▏ 定義

▏ 基本原理

我們經(jīng)常使用的轉染化學(xué)試劑有Lipofectamine/CaPO₄/FuGene/PEI等，原理基本是相同的：

1. 在體外混合質(zhì)粒和轉染試劑，質(zhì)粒DNA帶負電荷，轉染試劑帶正電荷，由轉染試劑包裹質(zhì)粒DNA在體外形成穩定的復合物；

2. 外圍帶正電荷的復合物，接觸到帶負電荷的細胞膜，穿透細胞膜，形成Endosome（一種真核細胞內的膜結合細胞器，屬于囊泡結構，是細胞內吞作用中物質(zhì)運輸的關(guān)鍵環(huán)節）；

3. 在細胞質(zhì)內釋放外源的質(zhì)粒DNA，DNA通過(guò)核孔進(jìn)入細胞核，參與外源基因的表達。

 

 

▏ 瞬時(shí)表達和穩定整合表達

 

 

 

常見(jiàn)質(zhì)粒轉染，沒(méi)有定點(diǎn)的、特殊的整合機制，因此當質(zhì)粒被遞送到細胞核中，整合是隨機發(fā)生的，而且只有一小部分質(zhì)粒會(huì )隨著(zhù)細胞DNA復制過(guò)程中的斷裂，經(jīng)過(guò)修復機制的作用，被整合到宿主的染色體基因組中。
 

因此我們總結幾個(gè)重要的特點(diǎn)：

1. 隨機整合，整合效率低，不一定會(huì )整合到轉錄活躍區；

2. 大量未整合的質(zhì)粒（以1x10e6轉染5 μg為例，以pcDNA3.1載體加上3000bp的目的基因為例，大約是5.37*10e11 copies），隨著(zhù)細胞分裂慢慢被稀釋或降解；

3. 一般24-96小時(shí)會(huì )形成一個(gè)瞬時(shí)表達的最高峰；

4. 被整合的拷貝需要經(jīng)過(guò)抗性（antibiotic）篩選得到陽(yáng)性細胞，并且后期需要抗性維持壓力；

5. 因為是通過(guò)DNA斷裂修復重組進(jìn)去的，所以后期也存在這個(gè)位置再次斷裂的可能性，進(jìn)而破壞了目的基因，因此可以說(shuō)穩定性是個(gè)挑戰，建議做單克隆穩定細胞株，做傳代穩定性分析；

6. 線(xiàn)性DNA比環(huán)狀DNA整合得更有效率，但是線(xiàn)性DNA比環(huán)狀DNA更難遞送；

7. 不同細胞類(lèi)型差異較大，表現在“遞送差異”和“整合差異”上；

8. 遞送的化學(xué)試劑，多少存在毒性，需要平衡遞送效率和毒性；

9. 被遞送的質(zhì)粒要去內毒素，內毒素會(huì )引起免疫反應。

  

▏ 應用場(chǎng)景

1

瞬時(shí)轉染，追求瞬間高拷貝/超拷貝的蛋白表達

2

穩定細胞株構建，生物安全等級低，對整和效率、整合位置要求不高


 

▏ 穩定細胞株構建服務(wù)

科佰生物提供“質(zhì)粒隨機整合系統”穩定細胞株構建服務(wù)，利用該系統，我們已經(jīng)成功構建超過(guò)500株穩定細胞株的模型，有著(zhù)豐富的經(jīng)驗，歡迎溝通咨詢(xún)。

		質(zhì)粒轉染		病毒感染	Flp-FRT系統	轉座子系統	基因編輯
		脂質(zhì)體	電轉	慢病毒
適用細胞		部分細胞	幾乎所有細胞	幾乎所有細胞	內部4種細胞	幾乎所有細胞	部分細胞
轉染/感染效率		低	中	高	高	高	低
隨機整合		是	是	是	否	-	否
生物安全等級		BL1	BL1	BL2	BL1	BL1	BL1
基因裝載能力		-	-	<4-5k	-	-	-
陽(yáng)性率		低	高	高	高	高	低
周期	基因合成	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周	2-3周
	病毒包裝	-	-	1周	-	-	-
	混合克隆篩選	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周	1-2周
	單克隆篩選	>3 周	>3 周	>3 周	可選	可選	>3 周
	合計	> 8-10 周	> 8-10 周	>9-11周	5-7 周	5-7 周	> 8-10 周
工作負荷		高	中	中	低	低	高